Identification and susceptibility of clinical isolates of Candida spp. to killer toxins / Identificação e susceptibilidade de isolados clínicos de Candida spp. para toxinas assassinas

Abstract Although invasive infections and mortality caused by Candida species are increasing among compromised patients, resistance to common antifungal agents is also an increasing problem. We analyzed 60 yeasts isolated from patients with invasive candidiasis using a PCR/RFLP strategy based on the internal transcribed spacer (ITS2) region to identify different Candida pathogenic species. PCR analysis was performed from genomic DNA with a primer pair of the ITS2-5.8S rDNA region. PCR-positive samples were characterized by RFLP. Restriction resulted in 23 isolates identified as C. albicans using AlwI, 24 isolates as C. parapsilosis using RsaI, and 13 as C. tropicalis using XmaI. Then, a group of all isolates were evaluated for their susceptibility to a panel of previously described killer yeasts, resulting in 75% being susceptible to at least one killer yeast while the remaining were not inhibited by any strain. C. albicans was the most susceptible group while C. tropicalis had the fewest inhibitions. No species-specific pattern of inhibition was obtained with this panel of killer yeasts. Metschnikowia pulcherrima, Pichia kluyveri and Wickerhamomyces anomalus were the strains that inhibited the most isolates of Candida spp.

Resumo Embora as infecções invasivas e a mortalidade causada por espécies de Candida estejam aumentando entre pacientes comprometidos, a resistência a agentes antifúngicos comuns também é um problema crescente. Analisamos 60 leveduras isoladas de pacientes com candidíase invasiva utilizando como estratégia PCR/RFLP baseada na região espaçadora transcrita interna (ITS2) para identificar diferentes espécies patogênicas de Candida. A análise por PCR foi realizada a partir de ADN genómico com um par de iniciadores da região ITS2-5.8S rDNA. As amostras PCR-positivas foram caracterizadas por RFLP. A restrição resultou em 23 isolados identificados como C. albicans usando AlwI, 24 isolados como C. parapsilosis usando RsaI e 13 como C. tropicalis usando XmaI. Em seguida, avaliou-se o grupo de todos os isolados quanto à sua susceptibilidade a um painel de leveduras killer previamente descritas, resultando em 75% sendo suscetíveis a pelo menos uma levedura killer, enquanto que as restantes não foram inibidas por qualquer cepa. C. albicans foi o grupo mais suscetível enquanto C. tropicalis teve o menor número de inibições. Não se obteve um padrão de inibição específico da espécie com este painel de leveduras killer. Metschnikowia pulcherrima, Pichia kluyveri e Wickerhamomyces anomalus foram as cepas que inibiram a maioria dos isolados de Candida spp.

Optimization of killer assays for yeast selection protocols / Optimización de la actividad killer para protocolos de selección de levaduras

A new optimized semiquantitative yeast killer assay is reported for the first time. The killer activity of 36 yeast isolates belonging to three species, namely, Metschnikowia pulcherrima, Wickerhamomyces anomala and Torulaspora delbrueckii, was tested with a view to potentially using these yeasts as biocontrol agents against the wine spoilage species Pichia guilliermondii and Pichia membranifaciens. The effectiveness of the classical streak-based (qualitative method) and the new semiquantitative techniques was compared. The percentage of yeasts showing killer activity was found to be higher by the semiquantitative technique (60%) than by the qualitative method (45%). In all cases, the addition of 1% NaCl into the medium allowed a better observation of the killer phenomenon. Important differences were observed in the killer capacity of different isolates belonging to a same killer species. The broadest spectrum of action was detected in isolates of W. anomala NPCC 1023 and 1025, and M. pulcherrima NPCC 1009 and 1013. We also brought experimental evidence supporting the importance of the adequate selection of the sensitive isolate to be used in killer evaluation. The new semiquantitative method proposed in this work enables to visualize the relationship between the number of yeasts tested and the growth of the inhibition halo (specific productivity). Hence, this experimental approach could become an interesting tool to be taken into account for killer yeast selection protocols.

En este trabajo se presenta un nuevo ensayo semicuantitativo que optimiza la detección de actividad killer en levaduras. Se evaluó la actividad killer de 36 cepas pertenecientes a las especies Metschnikowia pulcherrima, Wickerhamomyces anomala y Torulaspora delbrueckii, en vista del potencial uso de estas levaduras como agentes de biocontrol frente a las especies contaminantes de vinos Pichia guilliermondii y Pichia membranifaciens. Se comparó la efectividad de la técnica clásica basada en estrías (método cualitativo) con la del nuevo método semicuantitativo. El porcentaje de levaduras que mostraron actividad killer fue más alto cuando se utilizó el método semicuantitativo (60%) que con el método cualitativo (45%). En todos los casos, el agregado de 1% de NaCl en el medio permitió una mejor observación del fenómeno killer. Se observaron importantes diferencias en la capacidad killer de diferentes cepas dentro de la misma especie. Se detectaron dos cepas de W. anomala (NPCC 1023 y 1025) y dos cepas de M. pulcherrima (NPCC 1009 y 1013) con un amplio espectro de acción, ya que fueron capaces de inhibir el desarrollo de las tres levaduras sensibles evaluadas. La evidencia experimental demuestra la importancia de una adecuada selección de la cepa sensible al evaluar la actividad killer. El nuevo método semicuantitativo propuesto en este trabajo permite visualizar la relación entre el número de levaduras sembradas y el halo de inhibición del crecimiento (productividad específica). En conclusión, este método resulta una herramienta interesante para ser tenida en cuenta en los protocolos de selección de levaduras killer.

Spoilage yeasts in Patagonian winemaking: molecular and physiological features of Pichia guilliermondii indigenous isolates / Levaduras contaminantes en vinos patagónicos: características moleculares y fisiológicas de los aislamientos indígenas de Picchia guilliermondii

Yeasts belonging to the genus Dekkera/Brettanomyces, especially the species Dekkera bruxellensis, have long been associated with the production of volatile phenols responsible for off-flavour in wines. According to recent reports, the species Pichia guilliermondii could also produce these compounds at the initial stages of fermentation. Based on the abundance of P. guilliermondii in Patagonian winemaking, we decided to study the relevance of indigenous isolates belonging to this species as wine spoilage yeast. Twenty-three indigenous isolates obtained from grape surfaces and red wine musts were analyzed in their capacity to produce volatile phenols on grape must. The relationship between molecular Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) and physiological (killer biotype) patterns detected in indigenous populations of P. guilliermondii and volatile phenol production was also evaluated. Different production levels of 4-ethylphenol, 4-vinylguaiacol and 4-ethylguaiacol were detected among the isolates; however, the values were always lower than those produced by the D. bruxellensis reference strain in the same conditions. High levels of 4-vinylphenol were detected among P. guilliermondii indigenous isolates. The combined use of RAPD and killer biotype allowed us to identify the isolates producing the highest volatile phenol levels.

Las levaduras del género Dekkera/Brettanomyces, sobre todo la especie Dekkera bruxellensis, siempre han sido asociadas con la producción de fenoles volátiles responsables de aromas desagradables en los vinos. Recientemente, se ha demostrado que la especie Pichia guilliermondii también es capaz de producir estos compuestos, particularmente durante las etapas iniciales de la fermentación. Dada la abundancia de P. guilliermondii en las bodegas de la Patagonia, se decidió evaluar la importancia de algunos aislamientos indígenas de esta especie como levaduras alterantes de vinos regionales. Se evaluó la capacidad de producir fenoles volátiles en ensayos sobre mosto de 23 aislamientos de P. guilliermondii provenientes de superficie de uvas y de mostos de fermentación de vinos tintos. Asimismo, se analizó la relación entre los patrones moleculares (RAPD) y fisiológicos (biotipo killer) de estos aislamientos y la producción de fenoles volátiles. Se detectaron diferentes niveles de producción de 4-etilfenol, 4-vinilguayacol y 4-etilguayacol entre los aislamientos de P. guilliermondii analizados; sin embargo, los valores obtenidos fueron en todos los casos inferiores a los producidos por D. bruxellensis cepa de referencia en las mismas condiciones. En general, se detectaron altos niveles de 4-vinilfenol en los mostos fermentados con los aislamientos indígenas de P. guilliermondii. El uso combinado de RAPD-PCR y el biotipo killer permitió identificar los aislamientos que producen los niveles más altos de fenoles volátiles.

Identificación rápida y sensibilidad a toxinas killer de levaduras aisladas de micosis no sistémicas / Rapid identification and susceptibility to killer toxins of yeasts isolated from non-systemic mycoses

La identificación rápida y segura de los agentes etiológicos y el desarrollo de nuevos antifúngicos con blancos de acción más específicos resultarán en tratamientos de las micosis más efectivos y menos lesivos. Mediante un método molecular rápido (ITS1-5.8S ADNr-ITS2 PCR-RFLP) se identificaron 53 aislamientos de levaduras provenientes de infecciones no sistémicas registradas en hospitales públicos de la ciudad de Neuquén y en un centro oftalmológico de Buenos Aires durante el año 2005. Adicionalmente y utilizando el método de inhibición del crecimiento en placa, se evaluó la sensibilidad de estas levaduras a toxinas killer producidas por levaduras indígenas de la Patagonia y por cepas de referencia. Ocho especies de levaduras fueron identificadas entre los aislamientos clínicos: Candida albicans (52%) , Candida parapsilosis (17%) , Candida tropicalis (10%) , Candida krusei (5%) , Candida glabrata (4%) , Candida guilliermondii (4%) , Kluyveromyces lactis (4%) y Saccharomyces cerevisiae (4%) . El 69% de los aislamientos de la especie mayoritaria, C. albicans, se relacionó con infecciones vaginales. Por otra parte, el 61% de las levaduras provenientes de infecciones oculares correspondió a la especie C. parapsilosis. En las condiciones de ensayo, las toxinas producidas por las levaduras killer indígenas DVMais5 y HCMeiss5 pertenecientes a las especies Pichia anomala y P. kluyveri, respectivamente, exhibieron el mayor espectro de acción sobre las levaduras aisladas de materiales clínicos.

The use of quick and reliable yeast identification methods, as well as the development of new antifungal agents with more specific targets, will enable a more efficient treatment of mycoses. In the present work, a total of 53 clinical isolates obtained from non-systemic infections in Neuquén Hospitals and an ophthalmologic clinic in Buenos Aires during 2005, were identified by means of a rapid molecular method (ITS1-5.8S ADNr-ITS2 PCR-RFLP). Additionally, the killer susceptibility of the isolates was tested against reference and indigenous killer yeasts on plate tests. Eight yeast species were identified among the clinical isolates: Candida albicans (52%), Candida parapsilosis (17%), Candida tropicalis (10%), Candida krusei (5%), Candida glabrata (4%) , Candida guilliermondii (4%) , Kluyveromyces lactis (4%) and Saccharomyces cerevisiae (4%) . Sixty-nine percent of the isolates corresponding to the predominant species ( C. albicans) were related to vaginal infections. On the other hand, 61% of the yeasts associated with ocular infections were identified as C. parapsilosis. Two indigenous killer isolates DVMais5 and HCMeiss5, belonging to Pichia anomala and P. kluyveri respectively, exhibited the broadest killer spectrum against clinical isolates.